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细胞冻存的 7 个注意事项
人阅读 发布时间：2020-04-24 16:48
一、细胞冻存
方法：
冻存液最好现配：按 1:3:6（或 1:2:7） 配冻存液 1 份 DMSO3 份血清和 6 份培养基（养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基）。取生长状态量好的细胞进行冻存处理，对于贴壁细胞：
1、吸出旧培养液加 PBS 冲洗一次
2、胰酶消化
3、加培养基中止消化，有的细胞是加血清中止
4、离心收集细胞，不同细胞离心率不一样（以上仅为贴壁细胞，悬浮细胞收集就用第四部）
5、吸出离心管上清液，加 1mL 的冻存液重悬细胞，移到冻存管，放 4 度半小时，-20 度两小时，-70 度过夜，再放液氮长期保存
悬浮细胞：直接离心收集，PBS 洗涤
注意事项：
1、错误的时机：细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已 经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。
解决：最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。
2、细胞太少：冻存时细胞浓度低于 1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。
解决：离心后调整细胞浓度（不要重新洗细胞）。
3、盖子不紧：冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。
解决：选择原配的管子和盖子（不同牌子 / 型号的颜色会有差别）。
4、单薄的冻存盒：放在 -80 度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。
解决：选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！）
5、-80 度太久：放在 -80 度冰箱的时间超过半年（冰箱的温度难以恒定：开门 / 关门，电压不稳等）。
解决：尽快转入液氮。
6、液氮不足：液面不能漫过所有细胞。
解决：定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。
7、取错细胞：找不到 / 拿错冻存管。
解决：每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。
二、细胞复苏：
方法：
1、从液氮容器中取出冻存管，直接浸入 37 ℃ 温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2、从 37 ℃ 水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加 10 倍以上培养液，混匀；
3、离心， 1000 rpm，5 min；
4、弃去上清液，加入含 10% 小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37 ℃ 培养箱静置培养；
5、次日更换一次培养液，继续培养。
注意事项：
1、取错细胞：拿错冻存管（快快快，匆忙之中，难免出错，况且 -170 多度，冻手！）
解决：
（1）核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。
（2）拿细胞时戴手套！
2、水浴时间太长：2min 还没融化（冻存管的壁较厚，隔热）。
解决：
（1）适当提高水浴温度（37 度－40 度）。
（2）要是冬天，就选用保温盒。
3、冰盒内时间太长：复苏 1h 后，还没有加入新的培养液。（高浓度 DMSO 防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）
解决： 提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。
4、失去耐心：复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞（有些细胞复苏后一星期，才有起色）。
解决：不要换液，耐心等待，两周后再做决定，英格恩。
方法：
冻存液最好现配：按 1:3:6（或 1:2:7） 配冻存液 1 份 DMSO3 份血清和 6 份培养基（养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基）。取生长状态量好的细胞进行冻存处理，对于贴壁细胞：
1、吸出旧培养液加 PBS 冲洗一次
2、胰酶消化
3、加培养基中止消化，有的细胞是加血清中止
4、离心收集细胞，不同细胞离心率不一样（以上仅为贴壁细胞，悬浮细胞收集就用第四部）
5、吸出离心管上清液，加 1mL 的冻存液重悬细胞，移到冻存管，放 4 度半小时，-20 度两小时，-70 度过夜，再放液氮长期保存
悬浮细胞：直接离心收集，PBS 洗涤
注意事项：
1、错误的时机：细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已 经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。
解决：最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。
2、细胞太少：冻存时细胞浓度低于 1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。
解决：离心后调整细胞浓度（不要重新洗细胞）。
3、盖子不紧：冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。
解决：选择原配的管子和盖子（不同牌子 / 型号的颜色会有差别）。
4、单薄的冻存盒：放在 -80 度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。
解决：选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！）
5、-80 度太久：放在 -80 度冰箱的时间超过半年（冰箱的温度难以恒定：开门 / 关门，电压不稳等）。
解决：尽快转入液氮。
6、液氮不足：液面不能漫过所有细胞。
解决：定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。
7、取错细胞：找不到 / 拿错冻存管。
解决：每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。
二、细胞复苏：
方法：
1、从液氮容器中取出冻存管，直接浸入 37 ℃ 温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2、从 37 ℃ 水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加 10 倍以上培养液，混匀；
3、离心， 1000 rpm，5 min；
4、弃去上清液，加入含 10% 小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37 ℃ 培养箱静置培养；
5、次日更换一次培养液，继续培养。
注意事项：
1、取错细胞：拿错冻存管（快快快，匆忙之中，难免出错，况且 -170 多度，冻手！）
解决：
（1）核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。
（2）拿细胞时戴手套！
2、水浴时间太长：2min 还没融化（冻存管的壁较厚，隔热）。
解决：
（1）适当提高水浴温度（37 度－40 度）。
（2）要是冬天，就选用保温盒。
3、冰盒内时间太长：复苏 1h 后，还没有加入新的培养液。（高浓度 DMSO 防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）
解决： 提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。
4、失去耐心：复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞（有些细胞复苏后一星期，才有起色）。
解决：不要换液，耐心等待，两周后再做决定，英格恩。
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